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多肽設(shè)計(jì)簡(jiǎn)介

鴻肽生物在多肽領(lǐng)域多年深耕，積累經(jīng)驗(yàn)，在多肽設(shè)計(jì)方面，我們分以下幾個(gè)方面給出我們的建議：
多肽應(yīng)用介紹
隨著生物技術(shù)已經(jīng)生物工程科技的發(fā)展，多肽的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，通常，多肽的應(yīng)用有：

粗品多肽

藥物傳遞

抗體生產(chǎn)

藥物發(fā)現(xiàn)

疫苗研發(fā)

組織工程

核磁研究

蛋白相互作用研究

酶分析研究

siRNA傳遞研究

磷酸化抗體

非商品化抗體

抗菌藥物

癌癥藥物研究(GPCR激動(dòng)劑)

糖尿病藥物研究(GIP and GLP-1激動(dòng)劑)

神經(jīng)退化疾病藥物

艾滋病疫苗研發(fā)

癌癥疫苗研發(fā)

流感疫苗研發(fā)

人乳頭瘤病毒疫苗研發(fā)

水凝膠研究

干細(xì)胞研究

傷口愈合研究

多肽設(shè)計(jì)基本原則

多肽設(shè)計(jì)基本因素 I：電荷

電荷的影響：

溶解性

多肽活性

對(duì)鹽的結(jié)合能力

電荷取決于電離基團(tuán)：

N端氨基，C端羧基

側(cè)鏈R基，如Asp, Glu, His, Cys, Tyr, Lys, Arg

解性關(guān)系的關(guān)鍵因素：pH/pI：

pH= pI: 溶解度最低，沉淀

pH< pI: 凈正電荷

pH> pI: 凈負(fù)電荷

成鹽關(guān)系的關(guān)鍵因素：

Lys, His, Arg容易跟TFA, AcOH, HCl結(jié)合

Lys, Arg容易結(jié)合水分子

多肽設(shè)計(jì)的基本原則II：疏水性

疏水多肽的特性為：

長(zhǎng)度>5個(gè)氨基酸

序列包含50%以上的疏水氨基酸

解決辦法：將非必須的疏水氨基酸替換為帶電氨基酸或者極性氨基酸

多肽設(shè)計(jì)的基本原則III：多肽長(zhǎng)度

如果拋開(kāi)多肽合成的過(guò)程，但從設(shè)計(jì)的角度來(lái)說(shuō)，可以設(shè)計(jì)任意長(zhǎng)的多肽，但是由于多肽固相合成的特點(diǎn)，長(zhǎng)度越長(zhǎng)，多肽合成的難度越大，合成出來(lái)的多肽的純度越低，副產(chǎn)物也越多，純化難度增大，往往會(huì)導(dǎo)致多肽在合成階段就失敗了，因此實(shí)驗(yàn)也無(wú)從進(jìn)行，一般來(lái)說(shuō)，多肽長(zhǎng)度在15-20個(gè)氨基酸是適中的，長(zhǎng)度在30個(gè)氨基酸以?xún)?nèi)的多肽基本都可以正常合成，如果超過(guò)40個(gè)氨基酸的多肽，合成成功率會(huì)下降很多。

多肽設(shè)計(jì)的基本原則IV：多肽純度選擇

一般來(lái)說(shuō)，相同序列和修飾、相同數(shù)量的多肽會(huì)因?yàn)槠浼兌鹊牟煌鴥r(jià)格各異，純度越高，單位質(zhì)量的多肽價(jià)格也越高。鴻肽生物可以提供粗品、脫鹽，70%到99%不同純度級(jí)別的多肽供客戶(hù)按需選擇使用。 各種多肽純度及應(yīng)用范圍如下：

應(yīng)用領(lǐng)域

大規(guī)模功能性篩選

肽微陣列

作為制備抗體的抗原

層析法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)抗血清滴度

免疫印跡法（非定量）

酶底物肽（非定量）

封閉肽（非定量）

親和純化

磷酸化檢測(cè)

蛋白電泳的應(yīng)用和免疫細(xì)胞化學(xué)

標(biāo)準(zhǔn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和RIA（定量）

受體配體相互作用（定量）

體內(nèi)、體外 生物學(xué)測(cè)定

酶的研究和阻斷實(shí)驗(yàn)（定量）

NMR研究

質(zhì)譜分析

其他定量檢測(cè)

SAR研究

臨床試驗(yàn)

APIs(藥物活性成分)

工業(yè)品

X-ray晶體研究

其他敏感的實(shí)驗(yàn)：酶與底物、受體與配體相互作其他定量檢測(cè)

對(duì)應(yīng)建議純度

粗品多肽

>70%和>75%的多肽

>80%，>85%和>90%的多肽

>95%的多肽

>98%的多肽

多肽設(shè)計(jì)高級(jí)策略：多肽穩(wěn)定性影響因素

在多肽化學(xué)合成的過(guò)程中容易導(dǎo)致的多肽不穩(wěn)定及解決方案：

  • 不穩(wěn)定的原因
    容易產(chǎn)生這種不穩(wěn)定的序列或者氨基酸
    解決方案
  • 形成環(huán)化
    含有Asp-Gly
    N端為Gln
    將Asp替代為其他氨基酸
    將N端Gln乙?；?/div>
  • 形成二級(jí)結(jié)構(gòu)
    含有連續(xù)多個(gè)Glu, Ile, Leu, Phe, Thr, Tyr, Val
    Asp代替Glu
    Ser代替Thr
    Pro或者Gly代替每個(gè)重復(fù)的第三個(gè)氨基酸
  • 氧化
    含有Cys，Met
    Ser代替Cys
    Nle代替Met
  • 水解
    含有Asp-Gly或者Asp-Pro或者Asp-Ser
    用其他氨基酸來(lái)代替Asp
  • 產(chǎn)生顏色
    含有Trp
    用其他氨基酸代替Trp

外肽酶或者內(nèi)肽酶導(dǎo)致的多肽不穩(wěn)定及解決方案：

  • 外肽酶(例如氨肽酶，carboxypeptidases): 多肽對(duì)外肽酶的穩(wěn)定性與多肽N-端氨基酸有相關(guān)性：
    長(zhǎng)半衰期氨基酸: Met, Ser, Ala, Thr, Val, or Gly；
    短半衰期氨基酸：Phe, Leu, Asp, Lys, or Arg；

  • 內(nèi)肽酶(如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，胰肽酶E)
    對(duì)內(nèi)肽酶敏感的多肽特征為：富Pro, Glu, Ser和Thr區(qū)域；

  • 降低降解的策略: 環(huán)化，N端乙?；?，C端酰胺化，使用D型氨基酸替換對(duì)應(yīng)氨基酸，擬肽，訂書(shū)肽成環(huán)。

腎清除對(duì)多肽的影響及解決方案：

腎清除的特征：1) <25 kDa的親水多肽很容易被腎小球快速過(guò)濾清除；2）多肽不容易被腎小管被重新吸收。
降低腎清除的策略：將多肽偶聯(lián)到大分子或者聚合物上如：聚乙二醇(PEG)，多聚唾液酸(PSA)，羥乙基淀粉(HES)，牛血清白蛋白(BSA)，脂肽修飾等。

肽分析失敗的原因

肽分析失敗的原因通常為：1）氧化；2）多肽溶解性差；3）不適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)條件；4）TFA平衡離子污染；5）生物污染；

1）氧化

氧化的癥狀：

經(jīng)過(guò)一段時(shí)間多肽活性降低或者消失；

多肽顏色發(fā)生改變，從白色變?yōu)辄S色，棕黃色或者棕色。

容易氧化的多肽：包含Cys, Trp, Met氨基酸的序列。

預(yù)防措施：

設(shè)計(jì)優(yōu)化：使用Ser代替Cys，使用Nle代替Met。

多肽存儲(chǔ)保護(hù)：將多肽分裝（可以避免反復(fù)分裝）；將多肽用氬氣保護(hù)并將多肽儲(chǔ)存于密閉容器中。

多肽分析時(shí)保護(hù)：添加還原劑(抗氧化劑)：DTT, TCEP, β-mercaptoethanol；使用氬氣保護(hù)緩沖液；在無(wú)氧室中使用充氬水置換緩沖液和多肽；在無(wú)氧環(huán)境中進(jìn)行分析。

2）多肽溶解性差

多肽溶解性差的癥狀：

多肽溶解后渾濁或者有沉淀

多肽溶解性差的序列：序列長(zhǎng)度>5AA且包含Trp, Phe, Tyr, Met, Ile, Leu, Val超過(guò)50%的多肽序列。

多肽溶解性差的解決辦法：

溶解的時(shí)候遵循溶解指南;

合成多肽的時(shí)候要求做溶解性測(cè)試;

使用極性或者帶電荷氨基酸替代非必要疏水氨基酸;

引入O-?；鶊F(tuán)(如PEG);

引入親水性Linker(如：Lys-Lys-Lys-Lys);

對(duì)于肽庫(kù)可以進(jìn)行移碼;

3）不適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)條件

多肽存儲(chǔ)不當(dāng)?shù)陌Y狀：

經(jīng)過(guò)一段時(shí)間多肽活性降低或者消失；

凍干多肽從粉末狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫w狀；

容易受影響序列：包含Ser，Thr，Lys，Gly，Arg氨基酸的多肽序列。

解決辦法：

將多肽分裝（可以避免反復(fù)分裝）;

將多肽存儲(chǔ)于-20℃避光干燥處；

避免反復(fù)凍融；

多肽操作過(guò)程中”要”和”不要”：

對(duì)于所有多肽

對(duì)于包含Cys, Met, 或者Trp的多肽

對(duì)于包含Asp, Glu, Lys, Arg, 或者His的多肽

對(duì)于必須保存于溶液中的多肽

要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求實(shí)現(xiàn)分裝;

要避免反復(fù)凍融;

不要長(zhǎng)時(shí)間以溶液形式保存多肽;

不要反復(fù)打開(kāi)存儲(chǔ)多肽的管子;

要盡量避免將多肽暴露于空氣;

要盡量用氬氣或者氮?dú)獗Ｗo(hù)多肽或者緩沖液;

要用密封性好的容器保存多肽;

要盡量避免將多肽暴露于空氣;

要將多肽保存于干燥皿器中;

要用密封性好的容器保存多肽;

要避免反復(fù)凍融;

要根據(jù)日常實(shí)驗(yàn)需求將多肽溶液一次分裝好;

要用無(wú)菌溶劑溶解多肽;

要用0.2 μm的濾膜過(guò)濾去除多肽中的細(xì)菌污染;

4）TFA平衡離子污染

TFA平衡離子污染癥狀：

不穩(wěn)定的細(xì)胞或者組織活性以及酶分析結(jié)果；

IR圖譜結(jié)果；

質(zhì)譜響應(yīng)降低；

多肽降解；

容易產(chǎn)生TFA平衡離子污染的序列：所有的序列，特別是包含帶有正電荷的氨基酸Lys, His, Arg的多肽序列。

解決辦法：

選擇TFA去除服務(wù)或者脫鹽處理;

5）生物污染

生物污染癥狀：

內(nèi)毒素污染；

產(chǎn)生不需要的免疫反應(yīng)；

容易產(chǎn)生生物污染的序列：所有的序列。

解決辦法：

選用內(nèi)毒素去除服務(wù);

在無(wú)菌罩中打開(kāi)多肽容器;

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